Experimenteerprincipe
Hemoglobine-elektroforese heeft tot doel verschillende normale en abnormale hemoglobines te detecteren en te bevestigen.
Vanwege de verschillende ladingen en iso-elektrische punten van verschillende hemoglobinetypen, heeft hemoglobine in een bepaalde pH-bufferoplossing, wanneer het iso-elektrische punt van hemoglobine lager is dan de pH van de bufferoplossing, een negatieve lading en migreert het naar de anode tijdens elektroforese. Omgekeerd beweegt hemoglobine met een positieve lading naar de kathode.
Onder een bepaalde spanning en na een specifieke elektroforesetijd vertonen hemoglobines met verschillende ladingen en molecuulgewichten verschillende migratierichtingen en snelheden. Dit maakt de scheiding van afzonderlijke zones mogelijk, en daaropvolgende colorimetrische of elektroforetische scananalyse kan op deze zones worden uitgevoerd om verschillende hemoglobines te kwantificeren. De meest gebruikte methode is pH 8,6 celluloseacetaatmembraanelektroforese.
In het cytoplasma worden ethyleenglycolgroepen (CHOH-CHOH) die aanwezig zijn in glycogeen- of polysacharidestoffen (zoals mucopolysachariden, mucoproteïnen, glycoproteïnen, glycolipiden, enz.) geoxideerd door perjoodzuur en omgezet in aldehydegroepen (CHO-CHO). Deze aldehydegroepen combineren met het kleurloze paarsrode Schiff-reagens en vormen een paarsrode kleurstof die zich afzet waar polysachariden in de cel aanwezig zijn. Deze reactie staat bekend als perjoodzuur-Schiff (PAS)-kleuring, voorheen glycogeenkleuring genoemd.
Experimenteermethode
Materialen:Celluloseacetaatmembraan, elektroforese-apparaat(DYCP-38C en voeding DYY-6C), Superieure tool voor het laden van monsters (pipet), spectrofotometer, colorimetrische cuvetten, buffers.
Buffer:
(1) TEB-buffer met pH 8,6: Weeg 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g boorzuur af en voeg gedestilleerd water toe tot 1000 ml.
(2) Boraatbuffer: Weeg 6,87 g borax en 5,56 g boorzuur af en voeg gedestilleerd water toe tot 1000 ml.
Procedure:
Preparatie van hemoglobineoplossing
Neem 3 ml bloed dat heparine of natriumcitraat bevat als antistollingsmiddel. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2000 rpm en gooi het plasma weg. Was de rode bloedcellen driemaal met fysiologische zoutoplossing (750 rpm, telkens 5 minuten centrifugeren). Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2200 rpm en gooi het supernatant weg. Voeg een gelijke hoeveelheid gedestilleerd water toe en voeg vervolgens 0,5 maal het volume tetrachloorkoolstof toe. Schud krachtig gedurende 5 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 2200 rpm om de bovenste Hb-oplossing op te vangen voor later gebruik.
Het membraan weken
Snijd het celluloseacetaatmembraan in reepjes van 3 cm x 8 cm. Week ze in TEB-buffer met pH 8,6 tot ze volledig verzadigd zijn, verwijder ze vervolgens en dep ze droog met filtreerpapier.
Spotten
Gebruik een pipet om 10 μl van de hemoglobineoplossing verticaal op het celluloseacetaatmembraan (de ruwe kant) te plaatsen, ongeveer 1,5 cm van de rand.
Elektroforese
Giet de boraatbufferoplossing in de elektroforesekamer. Plaats het celluloseacetaatmembraan met de gevlekte kant aan het kathode-uiteinde van de kamer. Laat 30 minuten draaien op 200 V.
Elutie
Knip de HbA- en HbA2-zones uit, plaats ze in aparte reageerbuisjes en voeg respectievelijk 15 ml en 3 ml gedestilleerd water toe. Schud voorzichtig om de hemoglobine volledig te elueren en meng vervolgens.
Colorimetrie
Zet de absorptie op nul met behulp van gedestilleerd water voor de elutieoplossing en meet de absorptie bij 415 nm.
Berekening
HbA2(%) = Absorptie van HbA2-buisje / (Absorbantie van HbA-buisje × 5 + Absorptie van HbA2-buisje) × 100%
Berekening van experimentele resultaten
Referentiebereik voor pH 8,6 TEB Buffer Celluloseacetaat Elektroforese: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Opmerkingen
De elektroforesetijd mag niet te lang zijn. Het celluloseacetaatmembraan mag tijdens de elektroforese niet uitdrogen. Stop de elektroforese wanneer HbA en HbA2 duidelijk gescheiden zijn. Langdurige elektroforese kan banddiffusie en vervaging veroorzaken.
Vermijd het gebruik van te veel monster. Overmatig hemoglobinevocht kan leiden tot het loslaten van de band of onvoldoende kleuring, wat resulteert in vals verhoogde HbA-waarden.
Voorkom besmetting van het celluloseacetaatmembraan met eiwitten.
De stroom mag niet te hoog zijn; anders scheiden de hemoglobinebanden mogelijk niet.
Voeg altijd monsters toe van normale personen en noodzakelijke bekende abnormale hemoglobines als controles.
Beijing Liuyi Biotechnology produceert de professionele elektroforesetank voor hemoglobine-elektroforese, het modelDYCP-38Ccelluloseacetaatmembraanelektroforesetank, en er zijn twee modellen elektroforesevoeding beschikbaar voor de celluloseacetaatmembraanelektroforesetankDYY-2CEnDYY-6Cvoeding.
Ondertussen levert Beijing Liuyi Biotechnology klanten celluloseacetaatmembraan, en de grootte van het celluloseacetaatmembraan kan worden aangepast. Welkom om ons om monsters en meer informatie te vragen.
Het merk Beijing Liuyi heeft meer dan 50 jaar geschiedenis in China en het bedrijf kan over de hele wereld stabiele en hoogwaardige producten leveren. Door jarenlange ontwikkeling is het uw keuze waard!
We zijn nu op zoek naar partners, zowel OEM-elektroforesetanks als distributeurs zijn welkom.
Als u een aankoopplan heeft voor onze producten, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen. U kunt ons een bericht sturen via e-mail[e-mailadres beveiligd]of[e-mailadres beveiligd], of bel ons op +86 15810650221 of voeg Whatsapp +86 15810650221 toe, of Wechat: 15810650221
Posttijd: 20 september 2023